1856年6月过后，太平天国的力量空前强大，其内部隐藏的危机也开始蠢蠢欲动。此时，“永安建制”分封的五王之中有两王已经战死，余下的三王尤以东王杨秀清的权力最大。东王本就有节制其余四王的权力，再加上南王和西王已死，杨秀清的权力就更加膨胀了，就连天王洪秀全都要受他钳制。实际上，洪秀全虽然贵为天王，但在太平天国运动前期并未掌握实权。
这段时期，杨秀清经常自称被下凡的天父附体，乘机要挟洪秀全听从自己的命令。有一次，杨秀清故技重施，又称天父附到了自己身上，叫洪秀全速到东王府来。洪秀全过来以后，杨秀清便假借天父的名义向他提出了质疑：为什么为太平天国立下汗马功劳的东王却不能被称为万岁？洪秀全只好表示，东王绝对有被称为万岁的资格。
在此期间，北王韦昌辉和翼王石达开的亲友都曾因犯错而遭到杨秀清的严惩。韦昌辉和石达开虽然表面上不敢说什么，但私底下都对杨秀清十分不满。韦昌辉甚至恳请洪秀全将杨秀清处死，结果遭到了洪秀全的拒绝。当时洪秀全尚未对杨秀清动杀机，不过却已对其产生了深深的芥蒂。
其后，杨秀清又借口前线战事紧急，将韦昌辉和石达开都调离了天京。这样一来，天京就只剩下了洪秀全和杨秀清两人主持大局。这段时期，太平军中的将领陈承瑢开始在两人之间挑拨离间，因为这两人都非常信任陈承瑢，所以当陈承瑢向洪秀全告密说杨秀清密谋杀死天王取而代之时，洪秀全马上就对这个消息给予了高度的重视。
洪秀全向韦昌辉、石达开和秦日纲发出了密令，要求他们带兵赶回天京城，突袭东王府，将杨秀清诛杀。陈承瑢主动担当内应，迎接韦昌辉及其率领的三千名太平军入城。杨秀清被诛杀后，他的家眷、仆人也受到牵累，被韦昌辉、秦日纲和陈承镕率领的太平军杀得一干二净。不仅如此，韦昌辉还借着清除东王党羽的名义，在天京城内大开杀戒，总共有两万多人被杀，其中绝大多数都是无辜的将士甚至是平民百姓。
石达开回城之后，对韦昌辉滥杀无辜一事极为不满，并与之发生了冲突。韦昌辉一怒之下，居然又对石达开的家眷和部下大开杀戒。石达开在夜色的掩护下逃到了天京城外，但留在天京翼王府中其他人却被韦昌辉杀了个精光。
石达开在极度的悲愤之下上书天王，请求诛杀北王以平民愤。与此同时，石达开还组织天京城外的太平军在安徽安庆向韦昌辉开战。韦昌辉此刻已是人心尽失，索性领兵对天王府发起了进攻。很快，韦昌辉就兵败被杀，秦日纲和陈承瑢也被洪秀全下令处死。这就是天京事变的始末。
天京事变是天平天国由盛转衰的分界点，尽管此次事变最终平息下来了，但太平军中很多将士却因此变得心灰意冷。天京事变过后，“永安建制”分封的五王已经死去大半，翼王石达开成了硕果仅存的一个。当年11月，石达开被洪秀全召回天京，在奉命追缴韦昌辉的余党时，石达开表现得仁义、宽厚。他下令只对那些罪大恶极的首犯进行严惩，被迫参与的韦昌辉部下则不予治罪。对于韦昌辉的亲眷，石达开也保护有加，不让他们受到任何牵连。在石达开的努力下，天京的局势很快就平定下来了。
在天京事变发生的过程中，清军在与太平军的交战中逐渐占据了上风。石达开回京后，便指挥太平军先将局面稳定下来，再寻找机会对清军发动反攻。除此之外，石达开还提拔了陈玉成、李秀成等年轻将领，这些将领成了后期太平天国运动的中坚力量。
石达开所做的这些努力让他在太平天国的军民之中赢得了极高的声望，洪秀全因此对他产生了很深的猜忌之心，不再对他予以重用。这段时期，洪秀全开始重用自己的族弟洪仁玕。洪仁玕是太平天国后期的主要领导者，《资政新篇》就是由他提出的一套改革方案。
随着洪秀全对自己的猜忌愈演愈烈，甚至动了杀机，石达开终于走投无路，带兵出走，避开天王，希望通过这样的方式避免天京事变在朝中重蹈覆辙。在此之后，石达开率领太平军在浙江、福建等地先后取得了多次胜利，为太平天国运动的发展立下了不小的功劳。然而，从1859年开始，石达开便在与清军的对抗中占了下风。1863年5月，在大渡河一战中，石达开部被清军击败，两千名太平军将士被清军歼灭，主帅石达开也被生擒，后被凌迟处死。
早在天京事变平定之初，天京就再度遭到了清军的围困。由于自身的力量已遭到了严重的削弱，太平军便开始与捻军合作，并将长江以北的饥民编入太平军，以壮大太平军的力量，与清军抗衡。1858年8月，陈玉成和李秀成共同领导太平军击破了驻守在天京以北的江北大营。两个月后，又在庐州的三河镇一战中击溃了湘军的一支精兵。这两次战役的胜利，成功粉碎了清政府想要攻破天京，进而粉碎太平天国运动的企图。
局势平定下来以后，洪仁玕便在洪秀全的支持下提出了《资政新篇》。这是由中国人提出的最早的带有资本主义色彩的改革方案，其核心是向西方国家学习，在政治、经济、文化方面进行一系列改革。《资政新篇》的提出就是为了振兴太平天国，但是《资政新篇》问世之后，却没有真正实施过，原因就是它不是农民阶级革命斗争的产物，其内容根本就不涉及农民最关注的土地问题，因此它在调动农民革命和生产的积极性方面起不到任何作用，再加上当时局势动荡，根本就不可能被付诸实践。
太平天国安定了没多久，便再度开始了与清军的交战。1859年底，清军的江南大营卷土重来，围困了天京。第二年3月，太平军将江南大营击破，解除了天京之困。随后，太平军乘胜追击，决定先东进，然后再西上。太平军很快就攻陷了常州、苏州和嘉兴，并建立了苏福省，以苏州为省会，使其成为天京在东南方向的壁垒，并向天京提供物资供应。这一年，也就是1860年，是太平天国运动发展到后期，战绩最为辉煌的一年。
同年冬，陈玉成和李秀成再度出兵，兵分两路进入武昌。由于当时英国海军出兵帮助清军，让陈玉成心生顾忌，遂改变计划，放弃武昌，转而向麻城等地发起了进攻。此时，李秀成也退出了湖北，转战至浙江。1861年7月，曾国藩率领的湘军攻陷了安庆，并以此为根据地开始进攻天京。安庆失守后，陈玉成率领太平军退到庐州，孤立无援。第二年4月，陈玉成被俘，随后被处死。
1862年，曾国藩命令部下兵分三路，李鸿章率军赶赴上海，曾国荃前去进攻天京，左宗棠则奔赴浙江。在天京受到曾国荃率领的湘军围困后，洪秀全随即下令召回上海的太平军，江苏、浙江两地的太平军主力被迫返回天京，清政府乘机联合西方列强对当地的太平军发起了猛攻。一方面要抵抗清军，另外一方面还要抵挡列强的洋枪火炮，这段时期的太平军处境异常艰难。
当时，李秀成奉洪秀全的命令率军北上，结果在安徽北部粮草断绝，与此同时，清军一路高歌猛进，先后攻下了太仓、昆山、富阳、苏州等地。在这种情况下，李秀成向洪秀全提议放弃天京，以保全太平天国的实力，但洪秀全却固执己见，无论如何都要守住天京。1863年11月，洪秀全命令洪仁玕到丹阳等地召集当地的太平军赶赴天京。1864年初，天京陷入了清军的包围圈，城内粮食短缺，兵力不足。当年6月，洪秀全因病去世，其子即位为天王。7月，清军攻破了天京，李秀成带着幼天王出逃，却在逃亡途中与幼天王走散。7月22日，李秀成被俘，数日之后被处死。10月，清军在江西捕获了幼天王，并将其处死。太平天国运动就此宣告失败
。此后，太平军将领谭体元在长江南岸率领太平军余部坚持与清军作战，直到1866年才被彻底歼灭。同时，赖文光率领长江北岸的太平军余部加入捻军，直到1868年才随着捻军起义的失败而覆灭。1869年，左宗棠在陕西北部歼灭了袁大魁率领的起义军，这也是最后一支使用天平天国年号的起义军。
从1851年到1864年，太平天国运动总共延续了14年。作为一次反帝反封建的农民运动，太平天国运动是我国历史上规模最大、人数最多、持续时间最长的一次农民起义，给清政府带来了沉重的打击，在其影响下，全国各地的人民纷纷发动起义，反抗腐朽的封建统治。